Linked immunosorbent assay (ELISA)

Linked immunosorbent assay (ELISA) - moderní laboratorní testy, při kterých se provádí vyhledávání specifických protilátek v krvi nebo antigeny na konkrétní onemocnění, s cílem určit nejen příčinu, ale stádium onemocnění. Výsledky ELISA lze vydat jak kvalitativně, tak kvantitativně.

V současné době, ELISA se používá v následujících situacích:

1) vyhledávání specifických protilátek na jakékoli infekce zabolevaniyu-
2) hledat antigeny nemocem (infekčních onemocnění, pohlavními) -
3) studie hormonální stav patsienta-
4) screening onkomarkery-
5) testování na přítomnost autoimunitních onemocnění.

Výhody ELISA:

1) Vysoká specifičnost a citlivost testu ELISA (více než 90%).
2) Schopnost této nemoci dynamiky procesu, tj srovnání množství protilátek v různých časových intervalech určit a kontrolovat.
3) ELISA diagnostické dostupnost v každém zdravotnickém zařízení.

Relativní nedostatek:

1) Detekce imunitní odpověď (protilátky), ale ne z patogenu.

základní pojmy

Před objasnit podstatu metody ELISA, stručně to pochopit některé pojmy.
Protilátky (nebo imunoglobuliny - Ig) - specifické proteiny produkované B -
lymfocyty (buňky imunitního systému), v reakci na vstupu do těla infekčního patogenu (viry, bakterie, houby, atd.) Vylučují imunoglobulinu A (IgA), imunoglobulinu E (IgE), imunoglobulin M (IgM), imunoglobulin G (IgG), imunoglobulin D (IgD). Liší se od sebe navzájem a tvoří molekulovou hmotnost poloviny životní účast / nonparticipation v infekčních procesů, rozpoznat časování od okamžiku infekce. Pokud vezmeme v úvahu molekulové hmotnosti, nejvíce je to IgM - je pentamer (950000 Da), na rozdíl od zbytku Ig (150 až 200 000 Da), tak IgM jednoduše nemohou procházet placentární bariérou. Proto je detekce IgM v dětské 1 roku života je vždy příznakem infekce u plodu. Převážná sérových imunoglobulinů je reprezentován IgG (75-85%) a nejnižší - IgE (0,003%). Infekční proces přímo zapojen přičemž pouze IgA, M, G. IgE jsou známkou alergickými reakcemi a podmínkami, a IgD - mohou být detekovány pouze v lymfatických uzlinách a tonsil, hraje roli při tvorbě lokální imunitu.

tříd imunoglobulinů

antigeny - vysokomolekulární organické látky, zejména infekčních patogenů a dalších nemocí, jakož i různé látky modifikované buňky jsou produkovány v daném onemocnění (autoimunitní onemocnění, rakoviny).

imunitní komplex - antigen-protilátka, jež se podílejí na imunitní procesu.

Na čem je metoda ELISA.

Existuje několik druhů ELISA (přímá, nepřímá, blokující metoda soutěžícím), ale v praxi se nejčastěji používají heterogenní enzymového imunologického testu nebo testu ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)

Základem imunoanalýzy imunitní reakce antigenu a protilátky pro vytvoření imunitního komplexu: antigen-protilátka, což mělo za následek změnu v enzymatické aktivity konkrétních značek na povrchu protilátky.

Podstatou metody ELISA

Jednoduše řečeno, tento proces může být rozdělen do několika etap:

1) na povrchu desky lékař-ti jamkové průzkumový je vyčištěný antigen specifický patogen. Při přidání biologického materiálu (v krevním séru) pacienta specifické reakci dochází mezi antigenem a požadované protilátky (imunoglobulinu). Toto spojení bude fungovat jako „zvláštní antigenu“ v další etapě.

2) V této fázi je IR formace (imunokomplexy) - reakce mezi „specifický antigen“ a konjugátu (to imunoglobulinu značená peroxidázou enzymu). Přidá speciální chromogen. Výsledkem této enzymatické reakce je tvorba barevných látek v jamkách destičky, intenzita barvy, která je závislá na počtu imunoglobulinů pacientů (protilátky), obsažených v materiálu.

3) Dále Interpretace: fotometrie s použitím vícekanálové spektrofotometru porovnáním optické hustoty testovaného materiálu s optickou hustotou kontrolních vzorků, matematické zpracování výsledků. Množství protilátky v pacientovi, závisí na výšce optická hustota jamek.

Obvykle v praxi použití 96-jamkových destiček.

Při měření optické hustoty (OD) Objem vypočítá kapalný vzorek (nebo koncentrace) specifické protilátky v jednotce objemu. Výsledkem je pak ve srovnání s kontrolním vzorkem.

Je třeba mít na paměti:pro každý testovací systém vyvinutý brát v úvahu výsledky individuálního výkonu, standardy výkonu a patologii (tzn „referenční hodnoty“). To by se mělo vzít v úvahu při hodnocení výsledků každé případové studie. Správně interpretovat výsledky laboratorních „referenční hodnoty“ jiné laboratoře. Je také nesprávné porovnat výsledky z různých laboratoří společně.

Při stanovení ELISA reakce a má takovou hodnotu, koncept jako protilátky avidity.
avidity protilátky - vazba pevnost protilátky k antigenu a množství antigenu se nachází ve vzájemném vztahu s immnoglobulinami (protilátky). Avidita má velký význam při posuzování údajné infekce termínu, což je velmi důležité při diagnóze primární infekce u těhotných žen.

Základ testovaná protilátka avidita zahrnuje reakci imunitního komplexu (antigen-protilátka) roztoku močoviny s cílem zničit protein. Vysokoavidnye odkazy zůstanou neporušené a nízké avidity zničeny. Výsledek se udává jako index avidity, vyjádřený v procentech (%).

Jaké nemoci jsou detekovány ELISA-diagnostika?

1. Infekční nemoci
1.1 Virová hepatitida A (IgM, G), B antigeny -HBsAg, HBeAg, protilátka - IgM HBcorAg, Ig celkový HBcorAg, IgG HBeAg), C (protilátka Ig M, G HCV), D (IgM, G), E (Ig M, G) a další.
1,2 HIV infekce (IgG)
1.3 infekce cytomegalovirem (protilátky IgM, G)
1,4 Epstein-Barrové nebo infekce mononkleoz (IgM, G EA, VCA, NA virové proteiny)
1,5 Herpetické infekce (IgM, G)
1,6 toxoplazmóza (IgM, G)
1,7 Rubella (IgM, G)
1.8 Spalničky (IgM, G), brucelóza (IgM, G), pseudotuberculosis (IgM, G), salmonelózy (IgM, G), Shigelóza nebo úplavice (IgM, G), aspergilóza (IgM, G), klíšťová encefalitida, borelióza a mnoho dalších.
1,9 parazitózy (giardiáza, larvální toxokaróza, trichinóza, opistorhoz, echinokokóza, alveococcosis a další), v níž je detekovaná IgG
1.10 STD (pohlavně přenosných chorob prostřednictvím) - mykoplazmóza (IgM, G), Ureaplasmosis (IgM, G), chlamydie (IgA, M, G), syfilis (IgG)
1,11 Helicobacter infekce (IgG)

2. Markery autoimunitních onemocnění a imunitní systém ukazatele lidských (Total IgE, celkového IgG, celkový IgA, IgM celkem, celkový IgD, sekreční IgA, IgG2, IgG4, CRC cirkulujících imunokomplexů, IgA a IgG protilátek proti gliadinu a další)

3. Onkologichsekie markery (TNF - tumor nekrotizující faktor, CEA - karcinoembryonální antigen, PSA - prostatický specifický antigen, hCG - lidský choriový gonadotropin, CA 125, alveomutsin a mnoho dalších)

4. poruchy reprodukceI (estradiol, progesteron, prolaktin, testosteron, AFP AFP-, FSH - folikuly stimulující hormon, a další)

5. Onemocnění štítné žlázy (Volný a vázaný T3, T4, thyroglobulin, štítné žlázy peroxidáza - TPO, hormon stimulující štítnou žlázu - TTG).

Tento seznam není v žádném případě všechny nemoci jsou diagnostikovány testem ELISA.

Materiál pro analýzu ELISA a pravidla plot jejích

Nejběžnější materiál pro reakci IFA - pacientova séra, které bylo přijato na lačno. Materiál může také sloužit jako mozkomíšní mok, plodová voda, sklovitých obsah, hlenu děložního hrdla a uretry tampony.

Příprava pacientů na dodávku materiálu pro IFA

Odebere se krev na lačný žaludek. Před dodáním krve nemusí brát žádné léky. Specifická léčba (antibakteriální, antivirové, proti parazitům, a tak dále), musí být zastaven nejméně 2 týdny před studií.

IFA podmínky výroby

Imunosorbent materiál se koná rychle během dne. Zpoždění může být v různých laboratořích v důsledku nahromadění určitého množství séra.

Možné výsledky diagnostiky ELISA

Při posuzování výsledků určitých infekcí je důležitá třída protilátek identifikovaných a jejich počtu. To má vliv nejen na otázku etiologie infekce (tj, nebo ne), ale odhaduje stadium onemocnění (akutní a chronické), stejně jako přítomnost aktivní infekce (akutní nebo exacerbace chronické) v době průzkumu.

Jaké jsou přibližné načasování protilátek (imunoglobulinů - Ig)?

Nejdříve IgM protilátky. Mohou identifikovat pomocí 1-3 týdnů po případné infekce, které jsou charakteristické pro akutní fázi infekce. Druhý případ je vzhled IgM protilátek - aktivace (nebo exacerbace) chronický proces. IgM protilátky cirkulují v průměru asi 3 měsíce, pak se jejich počet postupně mizí. Nicméně u některých pacientů, stopová množství IgM mohou být detekovány v průběhu 1-2 let po infekci.

Moderní testovací systémy jsou velmi citlivé, takže tam jsou nespecifické falešně pozitivní výsledky (často u těhotných žen). Proto pozitivní IgM u této skupiny pacientů by měly být překontrolovány!

IgA protilátky objevují 2-4 týdny po infekci, ale v množství dostatečném pro detekci - měsíc. Sérum IgA syntetizován plazmatickými buňkami sleziny, lymfatických uzlin a slizničních sekrečních IgA soustředěných na sliznice plnit svou ochrannou funkci - podílejících se na lokální imunitu.

Na čtvrtý týden po infekci se začínají objevovat IgG protilátky. Ve většině infekcí titr postupně zvyšuje, s maximem v různých časech (v průměru 1,5-2 měsíců), pak je titr zůstává na nízké úrovni, a označuje imunitu. V některých onemocnění (mykoplazmózy, chlamydie, trichomoniáza) hladina IgG není vysoká, je výrazně snížena v důsledku nedostatku imunity u těchto infekcí.

Detekce provedení protilátek z různých tříd:

- Izolovaná detekce IgM protilátky znamená, že existuje primární
infekci.
- Simultánní detekci krve IgM a IgG typické pro primární infekce
V posledních 2-3 měsíců, jakož i zhoršení chronických onemocnění. Proto je přítomnost IgM v těhotenství není vždy údaj o počáteční infekce.
- Detekce IgG izolován a může ukazovat na imunitu proti onemocnění,
a chronická infekce. V druhém případě je nastaven a množství protilátek (titru) a změnou dynamiky titru. Typicky, byly provedeny studie s intervalem 2-4-6 týdnů.
- Detekce IgA nebo IgM izolované ukazují primární infekci. na
spolu s výskytem IgA IgG předpokládá aktivaci chronické infekce (průměrné 2 týdny od okamžiku exacerbace).

definice IgG avidity je perfektním doplňkem k diagnóze primární infekce fázi dlouhotrvající infekce, která má svůj klinický význam, a to zejména při posuzování rizika intrauterinní infekci plodu. Detekce nízké avidity IgG indikuje primární infekci a identifikuje průměr po 4-6 měsíců po infekci, zřídka déle. Nízká avidity IgG vyžadovat další laboratorní důkaz primární infekce (IgM). S vysokou aviditou protilátky jsou buď znakem chronických onemocnění a akutní nebo vytvořené imunity.

Zejména u dětí:u dětí do jednoho roku, a někdy i 1,5 let v krvi cirkulující mateřské IgG protilátek proti různým infekcím (tj byl jejich pronikání přes placentu z matky na plod v děloze). Je to samo o sobě svědčí o přítomnosti infekce v přítomnosti. Pokud se ve věku takjm detekovány IgM (připomeňme, že mateřská IgM přes placentu nemůže), je to znamení infekce nebo intrauterinní infekce získané po narození.

Kvantitativní metody ELISA

diagnostika Výsledky ELISA (pomocí enzymového imunotestu analyzátorem) se vydává v určitých jednotkách:
- Optická hustota (OD) vzorku - koncentrace specifické protilátky na jednotku objemu. Čím vyšší je OD vzorku, tím vyšší je koncentrace protilátek. Některé výsledky naznačují, faktor pozitivity (CP) - je také optická hustota vzorku.
- Jednotky koncentrace protilátky (ng / ml nebo ng / ml).
- V titru v séru: 1:20, 1:40, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1: 800, 1: 1200 a tak dále. Diagnostické titry (v němž je diagnostikována nemoc, spíše než na skutečnost, infekce) pro různé různými nemocemi.
- Ve formě symbolů - "+", "-" (+, ++, +++, ++++) "?".
- V rámci kvalitativního posouzení hodnotě kritéria (pozitivní nebo negativní).

Správně odhadnout množství protilátek variantních imunoglobulinů identifikace třídy, a v důsledku toho, vystavit stádium onemocnění a potřebu jen lékař může léčit.

Nesmíme zapomenout, že jejich „referenční hodnota“ (provedení norm) a nad kterou je konkrétní diagnostikována nemoc (varianty patologii) vyvinutý pro jakýkoli testovací systém. „Referenční hodnoty“ za různých testovacích systémů různé.

Správné porovnání výsledků ELISA, které byly v průběhu času, je možné pouze v případě, že jejich výroby ve stejné laboratoři.